类器官（Organoids）是由干细胞或多能干细胞培养分化而形成的三维小型结构，能够在一定程度上再现真实器官的结构和功能。判断类器官的成熟程度并在适当的时候进行传代，是确保类器官实验成功的关键。本文将分享如何判断类器官的成熟性以及其传代流程。

一、判断类器官成熟的标志

1. 形态学观察

成熟的类器官通常具有均匀的大小和规则的形状。不同类型的类器官有其特定的形态特征，肠道类器官通常呈现囊状，而脑类器官则可能展现神经球状结构。通常，第12-14天的肠道类器官适合进行传代，成熟的类器官应呈现出与真实器官相似的分层或分区结构，例如肠类器官的隐窝-绒毛结构和脑类器官的皮层样分层，这些特征皆可通过显微镜观察进行判断。

2. 细胞组成

成熟的类器官应包含多种细胞类型，例如在肠道类器官中需包含肠上皮细胞、杯状细胞和潘氏细胞等。可以通过免疫荧光染色或流式细胞术检测特定细胞标志物，例如Lgr5+干细胞和MUC2+杯状细胞。此外，成熟类器官中的细胞应完成分化，表现成熟细胞的标志物（如肠类器官中的Villin和脑类器官中的NeuN），可使用蛋白质免疫印迹（WB）检测其表达情况。

3. 功能检测

可以通过检测类器官的分泌功能（如肠类器官分泌黏液、胰腺类器官分泌胰岛素），电生理活性（如对神经类器官进行膜片钳检测），以及代谢活性（如ATP生成和氧气消耗率）来评估类器官的成熟性。此外，还需验证其是否具备预期功能，例如肠类器官的CFTR活性和心脏类器官的自我跳动能力。

4. 基因表达分析

采用qPCR或RNA测序方法检测与成熟相关的基因表达水平，例如肠类器官中的分化标志物和脑类器官中的神经元特异性基因。同时，通过检测类器官的DNA甲基化和染色质状态，可以判断其与体内成熟组织的相似程度。

二、类器官传代流程

1. 判断何时进行传代

在类器官生长过程中，当其直径达到200-500μm或生长速度明显减缓时，通常需要进行传代。同时，若培养基开始变黄也表明需要传代。若类器官结构不规则或出现中心坏死，亦需尽快传代。

2. 传代步骤

收集类器官：使用移液器轻轻吹打培养基，将类器官从基质胶中释放出来，并转移至离心管中。

消化类器官：加入适量消化酶，轻轻吹打使其解离成小细胞团或单细胞，消化时间根据类器官类型和消化酶浓度调整，通常为5-15分钟。

终止消化：加入含血清的培养基终止消化反应，并用移液器轻轻吹打，使细胞团均匀分散。

离心和重悬：以300-500g的速度离心5分钟，弃去上清液，并用新鲜培养基重悬细胞团。

重新接种：将细胞团与基质胶混合，接种到预热的培养板中，待基质胶凝固后，加入类器官培养基。

培养：将培养板放回37°C、5%CO₂培养箱中继续培养。

注意事项

（1）消化时间控制：消化时间过长可能导致细胞损伤，而过短则可能无法完全解离类器官。

（2）基质胶品质：使用高品质的基质胶以确保其均匀分布。

（3）培养基优化：根据类器官的类型选择合适的培养基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生长因子），确保类器官能够正常分化。

（4）污染防控：在操作过程中应保持严格的无菌环境，以避免类器官的污染。

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